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海巴戟天（诺丽）汁抑制人体血管生成
新生血管网络的破坏
路易斯安那州立大学健康科学中心
美国路易斯安那州健康科学中心
美国退伍军人管理局医疗中心
斯坦利斯科特癌症中心
美国神经科学卓越中心
摘要：诺丽果汁是从巴戟天植物果实中榨取的汁液，几个世纪以来一直被用作药物。我们使用人胎盘血管和人乳腺肿瘤作为血管生长的外植体来源，并使用三维纤维蛋白凝块矩阵模型来测试诺丽果汁的效果。与使用生理盐水的对照试验组相比，5%（体积分数）以上浓缩诺丽果汁对胎盘血管外植体上新生血管芽的生长有更明显的抑制作用。该浓度的诺丽果汁对于降低新毛细芽的生长速度和增殖速度也有显着的效果。当10%的诺丽果汁用于血管生长环境时，可以在几天内诱导肿瘤血管和毛细血管网络最终变性和凋亡。这项研究还发现，10%的诺丽果汁是人类乳腺肿瘤外植体中血管生长的良好抑制剂。在有血管生长的肿瘤外植体中，10%诺丽果汁可在23天内促进肿瘤血管快速变性和凋亡。
1简介
血管生长的定义由Folkman于1971年首次提出，进一步发展了之前关于血管网络生长的理论。在普通成年人中，除了排卵期间的反复生长和子宫内膜脱落之外，血管生长通常与病理过程有关。在各种病理情况下，如视网膜病变、类风湿性关节炎、牛皮癣、伤口愈合、肿瘤生长等，原本静止的血管内皮细胞会随之转变为血管生长状态。有人曾经认为，激活这个血管生成“开关”的分子机制是打破了血管内皮生长因子和抑制因子的自然动态平衡。激活血管内皮细胞生长的“开关”，然后细胞外基质被水解、降解，细胞随之迁移、增殖，从而形成相互交联的毛细血管结构和血管网络。中断或阻碍任何这些连续步骤都是可能的预防或改善症状。为此，目前正在审查许多化合物作为抗血管生成剂的功效。由此衍生出另一个想法，即阻止血管生长对新实体瘤的形成具有重要的抑制作用。该方法的目标是中断营养物质向肿瘤细胞的输送，导致肿瘤细胞因营养剥夺而发生凋亡。目前已有大量化合物，包括长春花生物碱、秋水仙碱、长春花碱、黄酮乙酸（FAA）等，有阻断肿瘤血管生长功效的研究报道，但需要较高浓度才能发挥作用，且通常会给患者带来严重的副作用。CompactinA4磷酸盐可以破坏肿瘤血管，同时保留周围正常血管组织。尽管周围血管区域的肿瘤继续生长，但这种现象意味着该药剂可以用作常规治疗的辅助剂。理想情况下，作用于脉管系统的抗癌药物会抑制新血管的生长，从而阻止肿瘤扩张和转移，同时攻击原发肿瘤本身的血管。
海巴戟天植物及其果实在南大西洋岛屿上被用作药用食品有着悠久的历史。萨摩亚、塔希提岛和夏威夷的人们使用巴戟天汁（诺丽果汁）来治疗糖尿病、心脏病、高血压、肾脏疾病和膀胱疾病，而果肉、叶子和树皮通常用作膏药来治疗疮口、伤口和脓肿。最近的研究表明，每天给植入Lewis肺癌细胞的小鼠腹腔注射诺丽果汁，可以显着延长小鼠的寿命。这一发现表明它对小鼠免疫系统有刺激作用。其他研究结果表明，海巴戟天的氯仿提取物（一种称为蒽醌的蒽醌化合物）可以诱导ras转化细胞的表型正常化。这项研究报告了海巴戟汁抗血管生长作用的数据。
2。材料和方法
2.1巴戟天
海巴戟（Noni）是市场上的商业产品。调节pH值至7.4，130Kgav离心18小时，除去残留细胞碎片，用0.2mNelgene滤膜过滤灭菌。
2.2血管生长模型
根据路易斯安那州立大学健康科学中心(LSUHSC)内部审查委员会(IRB)批准的方案，从匿名志愿者的废弃胎盘中获取胎盘静脉血管。将切除的静脉纵向切割，使较粗的静脉组织能够以平膜的形式充分显示。并使用无菌表皮切割器制作数个直径为2mm的静脉盘。然后将静脉板放入标准96孔培养板（康宁公司，康宁，纽约）中。培养板已预先填充凝血酶溶液（0.05IU，2l/孔），并在使用前蒸发至干燥。静脉盘在3小时内完成预处理过程，以确保内皮细胞活性。来自不同志愿者的静脉盘随机分布在治疗组中，以减少采样误差。
然后，用100l含有纤维蛋白原(3mg/ml)(Sigma,St.Louis,MO)和E-己酸(0.5%)(Sigma,St.Louis,密苏里州）。HPAM由培养基199(InvitrogenLifeTechnologies,Gaithersburg,MD)、抗生素/抗真菌溶液(100单位青霉素、100单位硫酸链霉素和0.25g/mL两性霉素)(InvitrogenLifeTechnologies,Inc.Gaithersburg,MD)Inc.Gaithersburg,MD)和内皮细胞生长培养基(25%)(InvitrogenLifeTechnologies,Gaithersburg,MD)。将上述物质混合形成凝块，在6%二氧化碳、94%空气、37的加湿培养箱中培养。培养基形成后，向含有静脉盘的凝块中补充100l含20%胎牛血清的HP-VAM，单板孔内液体体积为200l。
2.3血管生长评估
使用20倍或40倍显微镜，以标准化测量网格为参考，进行显微观察和测量。该方法可用于每隔一天评估所有板孔中血管的生长和萌芽情况。通过两个标准评估血管生长。首先，新血管的生长速率被定义为从静脉盘周边生长出至少三个长度约0.5mm的血管生长芽的增殖。基于视觉评分系统的血管生长指数（AI）是本研究中用于量化导管生长的第二个参数。每个静脉盘分为四个象限，血管生长从0到4进行评分。将所有4个象限的分数相加，血管生长指数将被描述为0到16的分数。这种方法使我们能够客观地评估实验每个孔中血管生长的程度。观察组(n=4)和治疗组之间的平均血管生长指数高度相关(90%或更高)。通过图像分析发现，血管的平均长度与平均血管生长指数有很高的相关性。
2.4血管网变性
在HPVAM中生长7天后，将120个血管外植体随机分为试验组和对照组（每组60孔板）。60孔板用10诺丽果汁处理，其他60个对照孔板用100.15摩尔氯化钠溶液处理。所有孔板均补充有新培养基（含有10%诺丽果汁或10%氯化钠），并每两天评估血管生长。实验结束时，诺丽处理组和对照组的活性也将使用基于四唑盐的测定（MTT测定活性试剂盒，PromegaInc.Madison，WI）进行测试。
2.5细胞凋亡
我们使用S7100ApopTag过氧化物检测试剂盒（Intergen，Purchase，纽约）检测海巴戟治疗组和10个对照组的10个血管外植体中的程序性细胞死亡，即细胞凋亡。该试剂盒的工作原理是基于末端标记法（TUNEL）检测DNA片段，利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）对单链或双链DN的游离3'-OH末端进行酶标记。我们可以发现，当细胞核破碎、细胞发生凋亡时，3'-OH末端标记的DNA量显着增加。然后可以使用抗地高辛过氧化物酶检测地高辛标记的DNA。简而言之，将组织外植体用10福尔马林处理并固定在石蜡中以制成石蜡切片，然后将石蜡去除的切片用蛋白酶K（20g/mL，Oncor公司）处理15分钟。用2%过氧化氢的PBS溶液处理内源性过氧化氢酶15分钟，然后冲洗切片，然后用平衡缓冲液处理15秒，除去多余的平衡液并立即添加末端脱氧核苷酸转移酶，将玻片置于37C培养箱中用于孵化。停止添加洗涤缓冲液，再孵育10分钟，然后在PBS中洗涤切片3次，并与两滴抗地高辛过氧化物酶一起孵育30分钟。用PBS洗涤载玻片3次，并用DAB处理切片4-6分钟。然后将载玻片用苏木精复染，在二甲苯中脱水，并在显微镜下检查。
图1：血管网络随时间的增长。图(A)显示了在可运输条件下增殖进行一周的情况（放大20倍）。图(B)显示受控条件下的增殖情况持续两周（放大20倍）。图(C)显示血管网络的图像（放大40倍）。
2.6数据
采用t检验方法对诺丽治疗组和对照组进行检验和比较。数据满足t检验方法的假设。所有统计检验都是双面的。
3个结果
这项研究表明，胎盘静脉外植体中的血管在实验开始后第24天开始生长。虽然在控制条件下，外植体中生长的血管数量不同，大多数初始生长率可以达到70-95%，少数初始生长率低至70%的外植体可以忽略不计。图1表明血管生长和胎盘外植体的生长在两周内是可控的。
图2(A)不同浓度诺丽果汁对人胎盘静脉外植体血管生成的抑制作用。将诺丽果汁在130Kgav下离心，通过0.2微米孔径的过滤器过滤，调节pH至7.4。所有诺丽测试的代表性数据均来自3个胎盘的60个外植体，具有不同的诺丽浓度。通过控制培养基体积相同（2.5%、5%、10%），添加0.15mol氯化钠，保证观察结果不受营养培养基多样性的影响。图中的控制点代表添加5%氯化钠。2.5%对照与2.5%诺丽果P=ns；5%对照与5%诺丽果P
图3(A)诺丽果汁抑制血管生成网络。在100%生长培养基中培养7天，在生长培养基中添加10%诺丽果汁，处理来自3个胎盘的30个外植体；在生长培养基中，来自同一胎盘的30个可控外植体用10%氯化钠处理。所有介质的pH值应平衡至7.4。计数时每两天更换一次培养基。两种处理之间差异非常显着，P
通过测试不同浓度诺丽果抑制血管生长和血液生长的功效来确定诺丽果汁的剂量效应。图2显示，当生长培养基添加到5%和10%的诺丽果汁中时，诺丽果汁抑制血管生长的效率较高，而浓度为2.5%的诺丽果汁则失去了抑制血管生长的效果。然而，在培养基中添加2.5%诺丽果汁可有效（P=0.005）降低毛细血管的生长和扩散速率（尽管诺丽含量低于5%和10%），见图2B。
胎盘外植体培养1周，然后置于10%诺丽果汁或10%氯化钠HPVAM中，观察诺丽对抑制血管生长和破坏血管网络的作用（图3A和3B）。实验中以10%氯化钠作为对照组，对血管的生长没有产生任何抑制作用。采用MTT法分析，处理的实验组呈深蓝色，表明诺丽处理孔中的细胞已发生凋亡。此外，大多数实验结果显示诺丽处理后血管完全降解，并且没有观察到血管生长（见图3A）。在外植体中，经过诺丽处理7天后，虽然血管组织仍然存活，但其形状大大缩小，血管网络的复杂性也大大降低（图3B）。血管的变性是由细胞凋亡过程中产生的球形囊泡引起的（图4和图5）。利用TUNEL实验（参见“实验材料与方法”），我们发现用10%诺丽培养基处理可以很大程度上诱导细胞凋亡（表1）。
人乳腺癌外植体在10%诺丽培养基中培养两周。与对照实验组相比，诺丽治疗组的人乳腺癌外植体的生长速度显着下降（图6A）。此外，与对照实验组相比（P=0.02，图6B），诺丽处理组外植体中血管生长的发生率显着降低（P=0.009）。
图4诺丽果对已建立的毛细血管网络的影响以三幅图呈现。图(A)显示了一周内受控环境中毛细血管的生长情况（2倍放大倍数）。(B)显示7天后10%诺丽果汁处理对同一外植体的影响（放大20倍）。(C)是图B的部分放大图，证实血管网络的退化非常明显（放大40倍）。
图5这两张图为10%诺丽果汁处理7天后诱导细胞凋亡的结果。圆圈A显示血管牛的长外植体，图B在10%NaClHPVAM环境中继续生长。完整的丝状血管网络（40倍放大倍率）。
4次讨论
本研究可以证实巴戟天汁具有以下功效：（1）抑制人胎盘静脉外植体新生血管的生长；(2)降低毛细血管的增殖率和静脉盘血管网的生长；(3)诱导新形成的血管网络凋亡；(4)抑制人乳腺癌外植体中的血管生成和血管发育。与之前的研究相反（腹腔注射诺丽果汁可以抑制小鼠Lewis肺癌细胞外植体的增殖），本研究发现诺丽在血管增殖过程中并没有激活免疫系统，因此在人体静脉中没有培养白细胞光盘。这种作用并没有表现出与虎醛相似的生理功能，正如我们发现诺丽果的氯仿提取物对血管生长没有抑制作用一样（数据尚未报道）。
虽然从现在获得的实验结果可以看出，诺丽果汁可以诱导细胞凋亡，但这意味着临床治疗中使用诺丽减少的血管网络形成很可能是依靠完全不同的机制来阻塞血管。生成，包括：个蛋白水解基质的降解；内皮细胞增殖；内皮细胞的迁移；毛细管发生；血管网络的吻合可能会抑制血管生成。我们发现，如图1所示，在培养基中添加2.5诺丽果汁对阻断血管生成没有作用(图1A)，但对血管的生长有重要作用(图1B)。我们在前期的研究中，明确了诺丽果中的抗血管生成成分，发现其活性分子既不是蛋白质，也不是脂质，而是可以阻止碳水化合物分子被偏高碘酸钠降解。诺丽果对血管生成的影响（数据未显示）。
图6(A)显示了人类乳腺肿瘤。将34个1mm外植体培养在96孔板上，分为对照组（n=17），用HPVAM10%NaCl培养，试验组用HPVAM10%Noni培养。将两组培养基的pH值调至7.4并过滤灭菌。使用Wilcoxon标记检验测量，不同处理组和对照组之间的差异显着，P=0.006。(B)是人类乳腺肿瘤。34个1mm外植体在96孔板上培养，分为对照组（n=17），用HPVAM10%NaCl培养。试验组用HPVAM10%诺丽培养。将两组培养基的pH值调至7.4并过滤灭菌。晓彤的治疗方法与对照组差异有显着性，P=0。002
处理7天后，固定外植体，切片，使用TUNEL法检测细胞凋亡，并使用苏木精复染。对载玻片上的三个随机区域进行细胞凋亡检测（过氧化物酶染色）和核完整性检测（苏木精染色包）。
如前所述，内皮细胞可以以静止或激活状态存在。另一项研究显示内皮细胞的流动状态
表1：在HPVAM中培养7天后，除去生长培养基，在HPVAM和10氯化钠的混合物中培养10个外植体，在含有10诺丽的HPVAM中培养其他10个外植体。
可以确定它们诱导细胞凋亡的敏感性。在一项实验中，内皮细胞使用蛋白酶抑制剂诱导细胞凋亡。内皮细胞增殖需要340倍的低浓度蛋白酶体抑制剂PSI才能诱导17%的细胞凋亡。如果诺丽治疗诱导细胞凋亡的机制与处于毛细血管汇合状态的内皮细胞相似，那么肿瘤已建立的血管网络可能能够抵抗诺丽治疗，从而使诺丽能够有效阻止新血管的形成。生成的同时保留完整的成熟血管。然而，新形成的毛细血管的易感性如图3和图4所示。在新形成的血管网络中，例如肿瘤血管网络中，存在高浓度的血管生长因子，血管内皮细胞很可能存在，有助于促进血管生成环境，从而增加细胞凋亡诱导剂的治疗效果，就像诺丽果一样。
诺丽果抗血管生成作用的一种可能机制是通过与细胞表面结构（如v整合素）的相互作用。其他
研究表明，血管生成可能由多种细胞因子诱导，并且可能与至少两种不同的整合素介导的血管生成途径有关。在碳水化合物等活性成分的存在下，诺丽果与某些生长因子结合可充当竞争性抑制剂。最近的研究结果表明，许多细胞因子的糖分子识别域和生物活性取决于与碳水化合物的结合。由此推断，整合素拮抗剂可以通过诱导新生血管细胞死亡来促进肿瘤消退。这是否是诺丽果的真正作用机制仍在积极研究中。
（选自英国《血管生成》、6:。）